摘　要：本文从猕猴桃目的基因的提取与克隆，遗传转化的方法及影响其转化效率的因素等方面进行了综述，并对猕猴桃遗传转化研究中存在的主要问题进行了讨论。

　　关键词：猕猴桃; 遗传转化; 研究进展

　　猕猴桃属于猕猴桃科猕猴桃属的多年生落叶藤本植物，其果实营养丰富，人体必需的矿物质、纤维素和维生素含量较高。此外，还具有药用价值，有水果之王之美誉。要获得高品质的猕猴桃，遗传转化无疑成为一种有效的现代生物技术。猕猴桃属雌雄异株，倍性复杂，雌雄株间花期不遇使种间杂交困难，育种周期长，且有不确定性。因此，需要引进新的手段和方法进行育种。目前，猕猴桃的遗传转化已取得很大进步，本文就猕猴桃遗传转化方面的研究进展做一综述。

　　1 已分离与克隆的猕猴桃目的基因

　　目前已被分离和克隆的目的基因，主要与猕猴桃果实成熟及衰老过程有关。从1993年开始，MacDiarmid和任小林等分别成功地从猕猴桃果实中分离和克隆出ACC氧化酶基因，导入猕猴桃，均可增猕猴桃的耐贮藏性。1997年王春霞等建立了由根癌农杆菌介导的西瓜高效遗传转化系统，来控制植株的寿命和果实早熟或耐储藏性。2003年宋喜贵等利用从番茄果实中分离到的ACC合成酶c DNA基因反向置于CaMV35S启动子的控制之下，并转入美味猕猴桃的愈伤组织中从而延缓植株衰老并提高其耐贮藏性。Atkinson等从美味猕猴桃中分离克隆出PG基因。任小林等还从美味猕猴桃中克隆了钙调蛋白c DNA。徐昌杰等从中华猕猴桃分离出的ACC合成酶家族四个成员的基因组DNA片段。

　　2 猕猴桃遗传转化的方法

　　遗传转化主要是将外源基因导入受体细胞中，使之发生定向的遗传变异。通常利用重组DNA，组织培养或种质系统转化等技术，其方法主要有农杆菌介导法、花粉管通道法等。目前，在猕猴桃遗传转化中应用的方法主要有农杆菌介导法、基因枪法、DNA直接摄取法等。

　　2.1 农杆菌介导转化法

　　包括根癌农杆菌和发根农杆菌介导法。该方法研究较成熟。农杆菌介导法获得稳定转化体的频率更高且重复性更好。

　　2.2 基因枪介导转化法

　　又称微弹轰击法，其将外源DNA片段包裹在微小金粒或钨粒表面，然后在高压作用下将微粒高速射入植物细胞或组织中，微粒上的外源DNA进入细胞后整合到植物染色体上，得到阳性表达从而实现基因转化。樊军锋等利用叶圆盘法和基因枪相结合，进行了秦美猕猴桃双价耐盐基因的转化研究并获得抗性转化植株。

　　2.3 DNA直接摄取法

　　DNA直接摄取法是将植物原生质体和外源DNA共培养，通过一定的化学和物理处理，使DNA进人植物细胞并得以表达。常见的有聚乙二醇法、电场诱导法等，通过改变细胞膜的通透性从而使原生质体获得转化。Oliver等以原生质体为受体系统，将外源基因cat(氯霉素磷酸转移酶)用电激法和PEG法转化美味猕猴桃原生质体获得成功。

　　3 猕猴桃遗传转化的影响因素

　　3.1 农杆菌菌株

　　3.1.1 菌株自身的影响因素

　　不同农杆菌菌株对猕猴桃侵染力有一定的差异，这些影响因素包括农杆菌的趋向能力;农杆菌表面存在不适合的成分阻止农杆菌对植物细胞的附着;农杆菌外膜信号受体蛋白不能有效地识别植物细胞分泌的诱导分子等。研究表明A281略好于C58，C58的感染力于EHA101，而LBA4404的转化频率差。但由于LBA4404菌株广谱性好，且易于保存繁殖，所以常用来进行猕猴桃转化研究。猕猴桃遗传转化的研究大多数都是农杆菌介导的，毕静华等对阔叶猕猴桃遗传转化的研究就是用农杆菌介导的。刘春林等获得的抗卡那霉素的美味猕猴桃抗性苗也是用根癌农杆菌介导的。

　　3.1.2 外界的影响因素

　　一般认为外植体在侵染前预培养一段时间，可以提高转化效率，然而在杜仲遗传转化中，预培养不但不能提高转化效率，反而降低了转化效率。Janssen和 Gardner研究发现猕猴桃叶片外植体经预培养后也降低了GUS瞬时表达率。刘婕等通过对蓝浆果农杆菌介导法基因转化条件的研究充分证明了外部条件对Gus基因瞬时表达率的影响。尚霄丽等也以中华猕猴桃伏牛95-2叶片为试验材料，对不同侵染方式、预培养时间等影响b-葡萄糖苷酸酶基因瞬时表达率的因素进行了研究。侵染时间和共培养时间是整个遗传转化中重要的因素，因为农杆菌的附着、T-DNA的转移整合都在这个时期完成，太长难以脱菌，太短又不能使菌液和外植体伤口表面充分接触，从而使T-DNA进入体内。

　　3.2 受体系统

　　猕猴桃主要以叶片或叶圆盘为受体。在获得的猕猴桃转基因植株中，有美味猕猴桃、中华猕猴桃和阔叶猕猴桃。1995年何子灿等研究了美味猕猴桃叶愈伤组织原生质体再生植株和母株茎尖体细胞染色体数目。1996年，张远记等从软枣猕猴桃试管苗茎段和叶片诱导出愈伤组织并得到再生植株。1997年，邱南新以中华猕猴桃外植体为材料，采用改建的T质粒对中华猕猴桃进行了遗传转化。

　　3.3 抗生素

　　毕静华等以阔叶猕猴桃叶片为外植体，研究了各种抗生素对形态分化和器官形成的影响，对不定芽分化来说，头孢霉素(Cerf)效果明显好于羧苄青霉素(Crab)。生根过程中高浓度的Cerf明显抑制生根，而Crab对生根没有显著影响。而在卡那霉素(Kan)和Crab组合处理中，Crab对生根没有显著影响，但Kan明显抑制生根。宋喜贵等在番茄ACC合成酶反义基因在转基因猕猴桃中表达的初步研究中探讨了在用卡那霉素进行筛选的条件下影响愈伤组织诱导率的一些因素。

　　4 猕猴桃遗传转化研究目前存在的问题

　　自从1983年次获得转基因植物后，至今已有35科120多种植物转基因获得成功。近年来，生物技术在猕猴桃遗传育种、品质改良上进展也很快，给猕猴桃育种带来了新的希望。但目前猕猴桃遗传转化仍存在问题：先是猕猴桃遗传转化比较复杂，目的基因不易分离且应用的外源基因都不是来自猕猴桃基因组本身;其次是猕猴桃的遗传转化主要采用根癌农杆菌介导和直接摄入法，这两种方法均要求外植体能够再生植株，需要时间很长且转化效率不高;同时，转基因产品可能产生一些潜在的负面影响，比如转基因猕猴桃果实的食用安全性以及可能带来的生态灾难等，既可能对环境产生不利影响，从而影响到生物多样性的保护和持续利用，也要考虑到对人类健康的威胁。